Von 1567 an König von Schottland und ab 1603 König von England, der trotz seines Rufes, gelehrt und vorurteilslos zu sein, als eine der treibenden Kräfte des Hexenwahns gilt, der im siebzehnten Jahrhundert in England und Schottland ausbrach. 1597 veröffentlichte er ein klassisches Traktat, in dem er die Notwendigkeit der Wachsamkeit gegenüber dem Hexenwesen betonte. Diese Schrift wurde von vielen als königliches Siegel der Billigung für jene betrachtet, die viel von der systematischen Verfolgung der Hexen in ihrer Mitte hielten.
Jakobs Überzeugung von der Existenz der Hexerei bildete sich wahrscheinlich heraus, als er einst als junger Mann einen Winter bei seiner zukünftigen Braut in Dänemark verbrachte. Hier kam er mit vielen bemerkenswerten europäischen Intellektuellen zusammen, die zu dieser Zeit von der vermeintlichen Bedrohung durch das Hexenwesen beunruhigt waren und an der Theorie arbeiteten, dass sich die Horden Satans über die gesamte zivilisierte Welt ausbreiteten. Kurz nach seiner Rückkehr schien sich die Furcht des Königs vor dieser Bedrohung zu bestätigen, als er 1591 im Holyrood Palace Agnes Sampson und andere Verdächtige in dem berüchtigten Fall der Hexen von North Berwick befragte. Unter der Folter, bei der der König persönlich zugegen war, gestand Agnes Sampson ihre Schuld ein und zog auch Francis Graf von Bothwell, den ehrgeizigen Cousin des Königs, in den Fall hinein, der Anführer eines Hexenzirkels sei und ein Komplott gegen die Krone geplant habe.
Jakob war von Agnes Sampsons Geständnis, dass sie und ihre Komplizen geplant hätten, ihn auf seiner Reise zu seiner zukünftigen Gemahlin Anne von Dänemark zu ermorden, besonders beunruhigt. Diesem Geständnis zufolge hatten sich die Hexen in Zaubersieben auf das Wasser des Forth begeben, als der König seine Reise nach Skandinavien antrat, und eine Katze ins Meer geworfen, an der Teile einer Leiche festgebunden waren, um damit einen Sturm heraufzubeschwören. Die Flotte des Königs war auch tatsächlich in ein Unwetter geraten, und ein Schiff - allerdings nicht das, mit dem Jakob reiste - war untergegangen. Nachdem dieses Komplott fehlgeschlagen war, hatten die Hexen ein Wachsbild von Jakob geformt, das sie beim Weitergeben von Hand zu Hand als König bezeichneten, ehe sie es über einem Feuer braten liessen.
Jakob hörte sich die Aussage der Agnes Sampson und der anderen Angeklagten aufmerksam an und brachte dann seine Zweifel an der Wahrheit des Gehörten zum Ausdruck. Schliesslich verlor er die Geduld und nannte die Frauen „ausgesprochene Lügnerinnen”, doch seine Stimmung änderte sich sehr rasch, nachdem Agnes Sampson ihm angeblich die Worte ins Ohr geflüstert hatte, die Jakob und seine Braut in ihrer Hochzeitsnacht gesprochen hatten. Der überraschte Jakob, der zugab, dass „all die Teufel in der Hölle das nicht hätten herausfinden können”, hatte nun keine andere Wahl mehr, als das Verbrechen der Angeklagten zu akzeptieren und den Schuldspruch gegen sie zu unterstützen. Agnes Sampson wurde später in Haddington hingerichtet. Als Barbara Napier, eine andere Angeklagte, freigesprochen wurde, weil sie schwanger war, beschuldigte James die Richter, eine „Gerichtssitzung des Irrtums” abgehalten zu haben:
Denn ich weiss, dass das Hexenwesen, ein Ding, das sehr häufig mitten unter uns gewachsen ist, eine höchst abscheuliche Sünde ist, und ich bin drei Viertel dieses Jahres damit geschäftig gewesen, jene unter ihnen ausfindig zu machen, die hierin schuldig sind. Die Gesetze Gottes und der Menschen lehren uns, dass diese Sünde höchst hassenswert und durch Gottes Gesetz mit dem Tod zu bestrafen ist. Vom Gesetz des Menschen wird sie maleficium oder veneficium - eine böse oder eine schädliche Tat - genannt und ist desgleichen mit dem Tod zu bestrafen.
Was die Richter veranlasst hat zu befinden, wie sie es getan haben, war die Tatsache, dass sie keine Aussage hatten ausser der von Hexen, die sie für ungenügend hielten. Durch das zivile Recht weiss ich, dass solch schändliche Personen nicht als Zeugen anerkannt sind ausser in Fällen von Häresie und lesae majestatis. Obwohl es auf andere Angelegenheiten nicht zutrifft, gibt es in diesen Fällen von Hexerei dennoch guten Grund, sie zuzulassen. Erstens kann ein ehrlicher Mensch nichts über diese Dinge wissen. Weil sie sich zweitens nicht selbst anklagen werden. Weil drittens keine ihrer Taten gesehen werden kann.
Ausserdem nenne ich jene Hexen, die Gott verleugnen und sich gänzlich dem Teufel überlassen; doch wenn sie es nicht getan haben, dann betrachte ich sie nicht als Hexen, und so ist ihr Zeugnis ausreichend.
Die Richter mussten sich für ihre Milde entschuldigen. Bothwell musste ins Exil gehen, wo er keine ernsthafte Bedrohung mehr für Jakobs Thron darstellte.
Auch wenn es vielleicht politisch motiviert war, veranlasste Jakobs Interesse an dem Prozess gegen Agnes Sampson und andere Mitglieder ihres Hexenzirkels den König, seine Gedanken zu diesem Thema in seiner Schrift Dämonologie festzuhalten, die 1597 - im selben Jahr, in dem der Massenprozess gegen die Hexen von Aberdeen stattfand - in Form eines langen Dialogs veröffentlicht wurde. Diese Abhandlung war zum Teil auch als Antwort auf Reginald Scots skeptisches Werk Disuroerie of Witchcraft aus dein Jahre 1584 geschrieben worden und unterstützte im grossen und ganzen den Gedanken, dass Hexerei eine reale Bedrohung darstelle. Jakob stellte allerdings die Stichhaltigkeit einiger Theorien zu den Fähigkeiten und Praktiken der Schwarzkünstler in Frage und warnte davor, Anschuldigungen ohne bestätigende Beweise zu akzeptieren sowie die Existenz von Werwölfen zu vernachlässigen. Andererseits unterstützte er die Praxis des Schwemmens und der Suche nach dem Teufelsmal, womit die Schuld einer angeklagten Person bestätigt werden konnte. Das Buch, das 1604 auch südlich der englisch-schottischen Grenze erschien, fand im gesamten Königreich eine aufgeschlossene Leserschaft. Die gesamte Auflage von Reginald Scotts Buch hingegen wurde 1603 auf königlichen Befehl verbrannt.
In seinem ersten Herrschaftsjahr als König von England peitschte Jakob ein neues Hexengesetz durch, das im Vergleich zu dem vorherigen Gesetz aus dem Jahre 1563 weit härter war, das Strafmass erhöhte und die Hexenjagd intensivierte. In Übereinstimmung mit dem Vorgehen auf dem europäischen Kontinent suchten die Gerichte nun nach Hinweisen auf den Pakt mit dem Teufel, statt sich auf den Nachweis wirklich begangener Maleficia zu konzentrieren. Zu Jakobs Entlastung muss gesagt werden, dass seine Vorbehalte gegen die Aussagekraft der Beweise in vielen Fällen sehr wohl bekannt wurden und zweifellos manche Ausschreitung der Gerichte zügelte, zu denen es ansonsten vielleicht gekommen wäre. Bei mehreren Gelegenheiten wich er von seiner gewohnten Art ab und kritisierte öffentlich die Richter, die es versäumt hatten, abenteuerliche Anschuldigungen, die sich allein auf Beweise vom Hörensagen gründeten, gebührend zu hinterfragen.
1616 demonstrierte Jakob seine vorsichtige Haltung gegenüber Beweismitteln in besonderen Fällen, als er den dreizehnjährigen John Smith verhörte, der im Mittelpunkt des Verfahrens vor den Assisen von Leicestershire stand. Neun Hexen waten bereits gehängt worden, weil man sie für schuldig befunden hatte, dem jungen Burachen ein Anfallsleiden angehext zu haben, und weitere sechs warteten wegen der gleichen Sache auf ihr Verhör. Jakob befragte den Jun-8en und kam - wie auch der Erzbischof - zu der Überzeugung, dass er eine Falschaussage gemacht hatte. Schliesslich gestand der Junge. Jakob erteilte den Richtern, Sir Randolph Crew und Sir Humphrey Winch, die neun unschuldige Frauen in den Tod geschickt hatten, eine strenge Rüge und forderte alle Juristen auf, Beweise künftig strenger zu beurteilen. Der Fall des Jungen von Bilson aus dem Jahre 1620, der mit dem Freispruch der Angeklagten endete, nachdem der minderjährige Kläger ähnlicher Weise zugegeben hatte, die Anschuldigungen erfunden zu haben, bestärkte Jakob in seiner Skepsis.
Es ist nicht anzunehmen, dass Jakob seinen Glauben an die Existenz der Hexerei gänzlich aufgab, doch es ist sicher, dass er gegen Ende seines Lebens von vielen Schlussfolgerungen, die er in seinem berühmten Buch gezogen hatte, Abstand nahm. In den letzten neun Jahren seiner Herrschaft wurden Berichten zufolge nur fünf Menschen wegen Hexerei hingerichtet. Nichtsdestoweniger wurden zur Verteidigung der strafrechtlichen Verfolgung vermeintlicher Hexen an den Gerichten auch weiterhin Textstellen aus Jakobs Dämonologie zitiert, und das Gesetz aus dem Jahre 1604 behielt seine Gültigkeit bis 1736.
Die Umstände des frühen Todes Jakobs I. sind von Geheimnissen umhüllt. Einige Zeit-genossen entdeckten eine weitere Verbindung zwischen dem Herrscher und dem Hexenwesen und behaupteten, Dr. Lamb, ein Verbündeter des Herzogs von Buckingham, habe den König mit Hilfe eines Zaubers vergiftet. Lamb selbst wurde später vom Londoner Pöbel gejagt und in Cheapside unter der Anschuldigung, er sei ein Hexenmeister, gesteinigt. Seine Assistentin Anne Bodenham, der man vorwarf, Gift verkauft zu haben, stand als Hexe unter Anklage und wurde gehängt.